How Will You Isolate and Characterise Salmonella spp. from Beef?

Isolation and Molecular Characterization of Salmonella spp. from Beef.

Author: Ferdous Hasan Mithun*

Introduction:

Innumberable foodborne zoonotic pathogen, Salmonella pose a serious threat to human health and food safety. It may present in the intestinal tract of chicken, cattle, swine, poultry and so on. For Salmonella isolation at least 25 gm of sample is required. Afterwards,it is necessary to culture in specific culture media and for farther confirmation PCR may required.

General Characteristics:

Morphology:

Family: Enterobacteriaceae

Gram-negative rods

Motile except Salmonella gallinarum and S. pullorum

Aerobic and facultatively anaerobic

Non-spore former, non-capsulated.

Cultural Characteristics:

Grow on ordinary culture media( Nutrient agar)

Aerobic/ Facultatively anaerobic

Temp. 15-41℃

Colonies appear as large 2-3 mm, circular, low convex

On MacConkey medium appear colorless ( NLF)

Selective medium – Wilson Blair Bismath Sulphide medium. Produce Jet black colonies H₂S produced by Salmonella typhi

Biochemical Characteristics:

Do not ferment lactose or sucrose

Do not produce indole

Ferment glucose, mannitol, maltose with production of acid and gas except S.typhi (produces acid only)

Most strain produces H₂S in TSI agar except S.paratyphi and S. choleraesuis

Methyl red : Positive

Materials and Methods:

Sample collection:

Isolation and Identification of Salmonella spp.

Bacterial genomic DNA extraction

Identification of Salmonella spp. by PCR

Materials:

Sample: Beef

Media: Salmonella-Shigella agar (SS), EMB agar, XLD agar and MH agar

Nutrient broth, Peptone broth, MR-VP and Sugar media.

Diluents: 0.1% Peptone water.

Homogenizer: Colwarth Stomacher blender

Others: Test tube, Petridishes, Conical Flask, Pipettes, Slides, Coverslips, Incubator, Freeze,Water bath,Microscope,Glass spreader, Gel-Electrophoresis apparatus etc.

Sample Collection:

The sample (Beef-500gm) was collected from commercial local market, Kewatkhali, Mymensingh and it was transported to the laboratory of the Dept. of Microbiology and Hygiene, BAU.

The sample was used to isolate and identify and also to characterized Salmonellae by biochemical,serological and molecular methods.

Isolation of Salmonella organism from Beef:

Step-1. 50 gm sample was taken from the collected sample

Step-2: Added diluent ( 0.1% Peptone water-450ml)

Step-3: Made homogenous mixture by Colwarth Stomacher blender and taken to the test tube( original sample)

Step-4: A series of test tubes, each containing 9ml of 0.1% Peptone water were taken

Step-5: 1ml transferred in test tube no.1 and mixed thoroughly

Step-6: From 1st tube, 1ml transferred to the 2nd tube and continued to the last tube and finally 1 ml discarded

Step-7: For each tube 3 petridishes taken which contain SS agar

Step-8: 0.5ml of mixture transferred from test tube to the petridishes

Step-9: After marking kept in the incubator ( 37℃for overnight)

Step-10: Pure black colony observed, indicates Salmonella spp.

Identification:

1. Pure black colony, subcultured on SS agar

2. Gram’s staining

3. Gram ( - ) ve , Small rod shaped bacteria

4. Subcultured on to XLD agar

5. Incubation at 37℃ at overnight

6. Small, circular pink colony with black center

7. It’s Salmonellae

Media Colony:

Gram Staining:

Biochemical Characteristics:

Molecular Characterization by PCR:

1.DNA Extraction

2. A pure bacterial colony was mixed with 100µl of distilled water

3. Boiled for 10 mins.

4. Immediately kept on ice for ice shock

5. Finally centrifugation was done at 10,000 rpm for 10 mins.

6. The supernatant were collected and used as DNA template for PCR

Primer Used for RCR:

Identification of Salmonella by PCR:

Genus specific PCR was performed to amplify inVA gene

Two set primers( SpeF and fimA) were used for this purpose

Each 20µl reaction mixture consist of 3µl genomic DNA, 10µl PCR master mixtures , 1µl of each of the two primers with the final volume adjusted to 20µl with 5µl of nuclease free water.

Amplification was done by PCR:

Initial denaturation at 94℃ for 5 mins.

Followed by 20 cycles of denaturation at 94℃ for 1 mins.

Annealing temp. of primer was 58℃ for 45 sec.

Elongation at 70℃ for 1 min

Final elongation at 72℃ for 2 mins.

The final holding temp. was 4℃

1% and 3% agarose gel were used for electrophoresis of SpeF & fimA gene respectively.

Fig. PCR for Salmonella typhimurium detecting fimA gene. (Lane1:100 by ladder,Lane2,3,4 were positive and 5,6,7 were negative and 8 was negative control

Fig.PCR for Salmonella gallinarum ( Lane1 was 1 kb ladder,Lane2,5 were negative for SpeF gene ,Lane3,4 were positive and 6 was negative control)

References:

Md. Shafiullah Parvej,June-2013.Isolation,identification and molecular characterization of Beef http://Salmonellae.Reaserchgate.net/publication/297563780

Ahmed AM,Shimabukuro H,Shimamoto T,2009.Isolation and molecular characterization of multidrug resistant strains of E.coli and Salmonella from reatail chicken meat in Japan. J.Food Sci.74:405

Jawad AAK, Hamadani AHA, 2011. Detection of fimA & fimC genes of Salmonella isolates using Polymerase Chain Reaction. J.of Basrah Reseaches(Sciences).37(4):1817-2695

Source of Personal Blog: https://vetferdous.blogspot.com/2021/09/Salmonella.html?m=1

What do you know about Papillomatosis/ Wart?

Papillomatosis/ Wart:

Papillomatosis/ Wart:

It's a typical case of Papillomatosis/ Wart. The causal agent is a virus named after the Papilloma virus. Most of the cases are found in Tarakanda Upazila, Mymensingh. It's a severe form of wart from where blood oozing from the lesion.

Virus Transmission:

The virus may transmit via direct contact or vectors like flies, mosquitoes, and other ectoparasites.

Prevalence Rate:

40–50% in that locality.

Morbidity & Mortality:

70–80% morbidity rate & mortality rate quite low in this case. But the animal has to suffer much.

Clinical Signs & Symptoms:

• Normal to medium range fever
• All cardinal signs are almost normal but may vary in some cases.
• The lesion looks like a tumor called papilloma. The characteristics of the area, hard to feel, rough, thickening of the surface of the papilloma.
• Sometimes ruptured of the wart and bleeding may occur.
• Anorexia is common in all diseases.
• Discomfort and drowsiness, etc.

Diagnosis:

Simply this disease can be directed and confirmed by seeing the lesion. In some cases,

ELISA, PCR, and other serological tests may need to confirm the diagnosis.

Differential Diagnosis:

Cow Pox, Lumpy Skin Disease ( LSD ), Hypersensitivity, etc.

Treatment:

1. Autohemotherapy: Collect 10 mo blood from the jugular vein and inject it into the deep muscle.
2. Auto genus vaccine: Preparation should be prepared in a laboratory following protocol.
3. Anthiomaline IM injection.
4. Surgical removal of the wart.
5. Other supportive treatment should be given.

Advice:

The owner should be in contact with a registered veterinarian immediately after observing the symptoms of the disease to prevent the loss of huge economical loss.

বিশ্ব জলাতঙ্ক দিবস ২০২১

আজ বিশ্ব জলাতঙ্ক দিবস:

জলাতঙ্ক কি?

একে হাইড্রোফোবিয়া কিংবা পাগলা রোগও বলা হয়। আক্রান্ত রোগী পানি দেখে বা পানির কথা মনে পড়লে প্রচণ্ড আতঙ্কিত হয়ে পড়ে বলে এই রোগের নাম হয়েছে জলাতঙ্ক। এটি প্রাণিবাহিত র‌্যাবিস ভাইরাসঘটিত রোগ, রোগের লক্ষণ প্রকাশ পাওয়ার পর আক্রান্ত রোগীর বেঁচে থাকার সম্ভাবনা প্রায় নেই বললেই চলে।

জলাতঙ্ক দিবস ২০২১

ক্ষতিকর প্রভাব কি?

বিশ্বে প্রতি ১০ মিনিটে একজন এবং প্রতিবছর প্রায় ৫৫ হাজার মানুষ জলাতঙ্ক রোগে মারা যান। বাংলাদেশেও বছরে গড়ে ৪০ থেকে ৫০ জন রোগী মৃত্যুবরণ করেন জলাতঙ্কে। শুধু মানুষই নয়, প্রতিবছর প্রায় ২৫ হাজার গবাদিপশুও জলাতঙ্কে আক্রান্ত হয়ে থাকে দেশে। রোগটি প্রতিরোধের লক্ষ্যে মানুষকে সচেতন করতেই গ্লোবাল অ্যালায়েন্স ফর র‌্যাবিস কন্ট্রোলের উদ্যোগে প্রতিবছর ২৮ সেপ্টেম্বর বিশ্বের বিভিন্ন দেশে জলাতঙ্ক দিবস পালিত হয়। দিবসটির এবারের প্রতিপাদ্য—জলাতঙ্ক: ভয় নয়-সত্য জানুন।

কিভাবে ছড়ায় ও লক্ষণ কি?

কুকুর, শিয়াল, বিড়াল, বাদুড়, বেজি, বানর ইত্যাদি প্রাণী জলাতঙ্ক সৃষ্টিকারী ভাইরাসে আক্রান্ত হলে এবং আক্রান্ত প্রাণীটি সুস্থ মানুষ বা গবাদিপশুকে কামড়ালে ওই মানুষ কিংবা গবাদিপশুও এ রোগে আক্রান্ত হয়। তবে আমাদের দেশে ৯৫ শতাংশ জলাতঙ্ক রোগ হয় কুকুরের কামড়ে এবং কুকুরে কামড়ানো ব্যক্তির ৪০ শতাংশই হলো ১৫ বছরের কম বয়সী শিশু।
আক্রান্ত প্রাণীর মুখের লালায় জলাতঙ্কের ভাইরাস থাকে। ভাইরাস বহনকারী এই লালা সুস্থ ব্যক্তির শরীরে পুরোনো ক্ষতের বা দাঁত বসিয়ে দেওয়া ক্ষতের মাধ্যমে কিংবা সামান্য আঁচড়ের মাধ্যমে রক্তের সংস্পর্শে এলে বা অতি দুর্লভ ক্ষেত্রে আক্রান্ত প্রাণীর লালা থেকে সৃষ্ট অ্যারোসল বাতাসের মাধ্যমে সুস্থ ব্যক্তির ফুসফুসে প্রবেশ করলে র‌্যাবিস ভাইরাস ধীরে ধীরে প্রান্তীয় স্নায়ুর মাধ্যমে মস্তিষ্কে পৌঁছায়। ফলে গলবিল এবং খাদ্যনালির মাংসপেশির কাজ নিয়ন্ত্রণকারী স্নায়ুও আক্রান্ত হয়। সাধারণত আক্রান্ত প্রাণী সুস্থ ব্যক্তিকে কামড়ানোর ২ থেকে ৩ মাসের মধ্যে রোগের লক্ষণ প্রকাশ পেয়ে থাকে। তবে এ সময়সীমা এক সপ্তাহ থেকে এক বছর পর্যন্তও হতে পারে।
শুধু পানির প্রতি আতঙ্কই নয়, জলাতঙ্কে আক্রান্ত ব্যক্তির আচরণেও কিছু অস্বাভাবিকতা দেখা যায়। অস্বাভাবিক কথাবার্তা ও ভাবভঙ্গির সঙ্গে সঙ্গে আক্রান্ত ব্যক্তি উদ্দেশ্যহীনভাবে ঘুরে বেড়ানো, ক্ষুধামান্দ্য, খাওয়াদাওয়ায় অরুচি, বিকৃত আওয়াজ, কণ্ঠস্বর কর্কশ হয়ে যাওয়া, মেজাজ খিটখিটে হওয়া, বিনা প্ররোচনায় অন্যকে আক্রমণ বা কামড় দেওয়ার প্রবণতা ইত্যাদি কিছু লক্ষণ দেখা যায়।

জলাতঙ্ক প্রতিরোধে করণীয়:

১. কুকুর, শিয়াল ইত্যাদি প্রাণি কামড় দিলেই সাথে সাথে উক্ত জায়গা ক্ষারীয় সাবান দিয়ে ১৫-২০ মিনিট ঘষুন ও ধুয়ে ফেলুন।
২. নিকটস্থ হাসপাতালে গিয়ে জলাতঙ্কের টিকা নিন ও ডাক্তারের পরামর্শ মোতাবেক সেবা গ্রহণ করুন।

মনে রাখবেন, সামান্য গাফেলতি প্রাণ নাশের কারণ হতে পারে। একবার জলাতঙ্কের লক্ষণ প্রকাশ পেলে তা নিরাময় করার কোন উপায় নেই। তাই আগেই সতর্ক ও সচেতন হোন।

Isolation and Molecular Characterization of Salmonella spp. from Beef.

Isolation and Molecular Characterization of Salmonella spp. from Beef.

Author: Ferdous Hasan Mithun*

Introduction:

Innumberable foodborne zoonotic pathogen, Salmonella pose a serious threat to human health and food safety. It may present in the intestinal tract of chicken, cattle, swine, poultry and so on. For Salmonella isolation at least 25 gm of sample is required. Afterwards,it is necessary to culture in specific culture media and for farther confirmation PCR may required.

Salmonella spp.

General Characteristics:

Morphology:

Family: Enterobacteriaceae

Gram-negative rods

Motile except Salmonella gallinarum and S. pullorum

Aerobic and facultatively anaerobic

Non-spore former, non-capsulated.

Salmonella characteristics

Cultural Characteristics:

Grow on ordinary culture media( Nutrient agar)

Aerobic/ Facultatively anaerobic 

Temp. 15-41℃

Colonies appear as large 2-3 mm, circular, low convex

On MacConkey medium appear colorless ( NLF)

Selective medium – Wilson Blair Bismath Sulphide medium. Produce Jet black colonies H₂S produced by Salmonella typhi

Chemical Characteristics

Biochemical Characteristics:

Do not ferment lactose or sucrose

Do not produce indole

Ferment glucose, mannitol, maltose with production of acid and gas except S.typhi (produces acid only)

Most strain produces H₂S in TSI agar except S.paratyphi and S. choleraesuis

Methyl red : Positive

Biochemical Characteristics

Materials and Methods:

Sample collection:

Isolation and Identification of Salmonella spp.

Bacterial genomic DNA extraction

Identification of Salmonella spp. by PCR

Meet sample

Materials:

Sample: Beef

Media: Salmonella-Shigella agar (SS), EMB agar, XLD agar and MH agar

Nutrient broth, Peptone broth, MR-VP and Sugar media.

Diluents: 0.1% Peptone water.

Homogenizer: Colwarth Stomacher blender

Others: Test tube, Petridishes, Conical Flask, Pipettes, Slides, Coverslips, Incubator, Freeze,Water bath,Microscope,Glass spreader, Gel-Electrophoresis apparatus etc.

Sample Collection:

The sample (Beef-500gm) was collected from commercial local market, Kewatkhali, Mymensingh and it was transported to the laboratory of the Dept. of Microbiology and Hygiene, BAU.

The sample was used to isolate and identify and also to characterized Salmonellae by biochemical,serological and molecular methods.

Isolation of Salmonella organism from Beef:

Step-1. 50 gm sample was taken from the collected sample

Step-2: Added diluent ( 0.1% Peptone water-450ml)

Step-3: Made homogenous mixture by Colwarth Stomacher blender and taken to the test tube( original sample)

Step-4: A series of test tubes, each containing 9ml of 0.1% Peptone water were taken

Step-5: 1ml transferred in test tube no.1 and mixed thoroughly

Step-6: From 1st tube, 1ml transferred to the 2nd tube and continued to the last tube and finally 1 ml discarded

Step-7: For each tube 3 petridishes taken which contain SS agar

Step-8: 0.5ml of mixture transferred from test tube to the petridishes

Step-9: After marking kept in the incubator ( 37℃for overnight)

Step-10: Pure black colony observed, indicates Salmonella spp.

Identification:

1. Pure black colony, subcultured on SS agar

2. Gram’s staining

3. Gram ( - ) ve , Small rod shaped bacteria

4. Subcultured on to XLD agar

5. Incubation at 37℃ at overnight

6. Small, circular pink colony with black center

7. It’s Salmonellae

Media Colony:

Salmonella colony on SS agar

Cultural Characteristics on EMB agar

Gram Staining: 

Gram Staining

Colony on XLD agar

Fig. Biochemical Characteristics

Biochemical Characteristics:

Molecular Characterization by PCR:

DNA Extraction

A pure bacterial colony was mixed with 100µl of distilled water

Boiled for 10 mins.

immediately kept on ice for ice shock

Finally centrifugation was done at 10,000 rpm for 10 mins.

The supernatant were collected and used as DNA template for PCR

Primer Used for RCR: 

Fig. Primer

Identification of Salmonella by PCR: 

Genus specific PCR was performed to amplify inVA gene

Two set primers( SpeF and fimA) were used for this purpose

Each 20µl reaction mixture consist of 3µl genomic DNA, 10µl PCR master mixtures , 1µl of each of the two primers with the final volume adjusted to 20µl with 5µl of nuclease free water.

Amplification was done by PCR:

Initial denaturation at 94℃ for 5 mins. 

Followed by 20 cycles of denaturation at 94℃ for 1 mins.

Annealing temp. of primer was 58℃ for 45 sec.

Elongation at 70℃ for 1 min

Final elongation at 72℃ for 2 mins.

The final holding temp. was 4℃

1% and 3% agarose gel were used for electrophoresis of SpeF & fimA gene respectively.

Fig.PCR for Salmonella gallinarum ( Lane1 was 1 kb ladder,Lane2,5 were negative for SpeF gene ,Lane3,4 were positive and 6 was negative control)

Fig. PCR for Salmonella typhimurium detecting fimA gene. (Lane1:100 by ladder,Lane2,3,4 were positive and 5,6,7 were negative and 8 was negative control 

References:

Md. Shafiullah Parvej,June-2013.Isolation,identification and molecular characterization of Beef Salmonellae.Reaserchgate.net/publication/297563780

Ahmed AM,Shimabukuro H,Shimamoto T,2009.Isolation and molecular characterization of multidrug resistant strains of E.coli and Salmonella from reatail chicken meat in Japan. J.Food Sci.74:405

Jawad AAK, Hamadani AHA, 2011. Detection of fimA & fimC genes of Salmonella isolates using Polymerase Chain Reaction. J.of Basrah Reseaches(Sciences).37(4):1817-2695